שיטת ה-PCR חוללה מהפכה בתחום הביולוגיה וזיכתה את ממציאיה בפרס נובל. הגאונות של השיטה היא הקלות בה היא מאפשרת יצירת כמות אדירה של DNA מכמות זעומה על ידי שימוש באמצעים פשוטים יחסית
ה-PCR משמש למחקר בביולוגיה, כמו גם בבדיקות גנטיות, זיהוי פלילי, מחקר רפואי, ולמעשה כל יישום המערב שימוש ב-DNA ושיש בו צורך לשכפל רצפי DNA.
הסרטון שלפנינו מתאר את שיטת ה-PCR על שלביה השונים:
לשכפל את ה-DNA
בשביל לשכפל את מקטעים מה-DNA צריך קודם כל להפריד בין שני גדילי מולקולת ה-DNA. הפרדה זו מתרחשת כמעט בכל פעם שתא משתכפל. כשהגדילים מופרדים, אנזים בשם DNA polymerase מתחבר לאחד הגדילים. את נקודת החיבור הוא מזהה באמצעות "כתובת" או פריימר (תחל) - מקטע קטן ומשלים לרצף ה-DNA ממנו יש להתחיל את מלאכת השכפול. כשמשתמשים ב-PCR, הכתובת הזו מיוצרת באופן באופן סינטטי, והיא מכילה רצף של נוקלאוטידים משלימים לרצף אותו רוצים לשכפל. לאחר הזיהוי, ה-DNA polymerase יתחיל להרכיב מחדש את הרצף המשלים של ה-DNA באיזור המפורד.
ה-PCR עושה שימוש בעקרון זה, רק שהוא חוזר על השלבים עשרות פעמים ובכך מכפיל את כמות ה-DNA פי שתיים בכל שלב. למעשה, שני עותקים התחלתיים של ה-DNA יכולים להפוך ליותר ממליארד עותקים תוך 30 חזרות. היופי שבשיטה הוא שהיא לא מגבירה את כל ה-DNA, אלא רק מקטע ספציפי אותו קובעים מראש. לשם כך בוחרים זוג פריימרים - קטעי DNA התוחמים את האזור אותו רוצים להגביר: כתובת המוצא, וכתובת היעד. כל פריימר מתאחה עם גדיל אחר, ובכך מגדיר את מקטע ההגברה.
שלבי ה-PCR
ל-PCR יש מספר שלבים מחזוריים בהם חושפים את ה-DNA, האנזימים, והנוקליאוטידים שנמצאים יחד במבחנה לטמפרטורות עבודה משתנות. מרכיבים הדרושים לתגובה הם:
- תבנית DNA דו גדילי ממנה ובה קטע שרוצים לשכפל
- זוג פריימרים - כתובות המקטע המבוקש
- אבני הבניין של ה-DNA שישמשו לבניית המקטעים המשוכפלים, המכונים נוקלאוטידים
- האנזים DNA polymerase שאחראי על חיבור הנוקליאוטידים החדשים ל-DNA המופרד
- תמיסת מלחים המאפשרת את קיום התגובה.
שמים את כל אלו במבחנה, ומכניסים אותם למכשיר ה-PCR. שלבי התגובה הם: פרימה של ה-DNA (denaturation), איחוי (annealing) והתארכות (elongation). שלב הדנטרציה מתבצע ב-95 מעלות, ובמהלכו שני גדילי ה-DNA נפרדים. שלב זה אורך כחצי דקה. בשלב הבא מתאחים שני הפריימרים על הגדילים המנוגדים. שלב זה מתבצע בטמרטורה של בין 45-70 מעלות וזה תלוי באורך והרכב הפריימרים, כשגורמים שונים משפיעים על הטמפרטורה ומשך הזמן היעילים ביותר. בשלב ההתארכות, ה-DNA polymerase נקשר אל הפריימרים ומתחיל לסנתז DNA במורד הגדיל.
בתום המחזור הראשון, אם יצאנו ממולקולת DNA יחידה קיבלנו שתי מולוקולות DNA לא שלמות - כלומר, הם מסונתזות רק החל מאחד מהפריימר שנקשר אליהן, שכן כל גדיל נקשר רק לפריימר אחד. בתום המחזור השני נקבל כבר ארבע מולקולות מתוכן אחת מכילה רק את המקטע הרצוי. בתום השלב השלישי, כבר יהיהו לנו שמונה מולקולות DNA מתוכן ארבע מכילות רק את המקטע הרצוי. בתום השלב הרביעי יהיו לנו 16 מולקולות DNA מתוכן 8 מכילות את המקטע הרצוי וכך כמות ה-DNA רק עם המקטע הרצוי יגדל באופן לוגריטמי (מעריכי).
בתום התגובה, מספר מולוקולות המכילות שאריות מה-DNA המקורי שאינו במקטע הנבחר יהיה כל כך נמוך ביחס לשאר, שזה יהיה זניח, וזאת משום שקצב הריבוי שלהם הינו קצב ישר (לינארי) אם יש 30 שלבים, יהיו 60 מולקולות ביחס ליותר ממליארד המולוקולת של המקטע.
מעבר ל-DNA
שיטת ה-PCR הולידה שיטות רבות כמו ה-realtime PCR המאפשרת מעקב בזמן אמת אחר קצב התרבות ה-DNA, מכאן ללמוד על קצב ביטוי הגן אותו הוא מקודד. שיטה נוספת היא ה- RT-PCR (RT - Reverse trasncription). שיטה זו מאפשרת הפיכת RNA ל-DNA על ידי הוספת האנזים reverse transcriptase שמקורו בוירוס ה-HIV. האנזים והופך RNA ל-DNA ומגביר את ה-DNA באופן שבו פועל DNA. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד כמה פעמים גן מסוים משועתק - כלומר, "הופעל" והתבטא ברקמות או תאים שונים.
מכאן, השמיים הם הגבול: אפשר להשתמש ב-PCR כדי לשתול מקטעים ואתרי חיתוך ל-DNA, יצירת מוטציות באופן מכוון תוך כדי תהליך השיכפול, ולעוד יישומים רבים ומגוונים.
