רואים קרוב,
רואים שקוף

מיקרוסקופ האור הוא אחד הכלים הוותיקים ביותר שמשמשים את הביולוגים, וראשיתו כבר במאה ה-17, בימי אנתוני ון-לוונהוק  ורוברט הוק. בזכותו אנו מבינים כיום ממה מורכבים התאים בגופנו ואיך הם פועלים, ויודעים לזהות גם יצורים שאינם נראים לעין בלתי מזוינת, כמו החיידקים.

האם נשאר עוד מה לחדש בכלי כל כך מוכר וישן? העשורים האחרונים מוכיחים בבירור שכן, כשפיתוחים בתחום האופטיקה והמיחשוב מאפשרים יותר ויותר תגליות פורצות דרך שלא היו קורות בלעדיהם.

בעין העדשה

מיקרוסקופ האור המודרני מורכב משתי עדשות מגדילות: עדשות אובייקטיב בעוצמות הגדלה שונות שפונות לעבר העצם הנחקר ועדשת עינית, שמגדילה פי 10, ודרכה החוקר מסתכל. בניגוד למיקרוסקופים הראשונים, כיום עדשת האובייקטיב אינה עדשה אחת אלא מערך של כמה עדשות שמאפשרות עם העינית הגדלה של עד פי 1,500.

למרות כושר ההגדלה המרשים, שני גורמים מגבילים את השימוש במיקרוסקופ: ניגודיות (קונטרסט) וכושר הפרדה (רזולוציה). ניגודיות היא היחס בין הבהירות של עצמים בתמונה לבין הבהירות של סביבתם. במילים פשוטות, ככל שעצם כהה יותר או בהיר יותר יחסית לסביבתו, כך קל יותר להבחין בו. כושר ההפרדה מתייחס למרחק הקטן ביותר בין קווים או נקודות שבו עדיין אפשר להבחין ביניהם.

מכיוון ששכבת תאים היא שקופה ברובה, הניגודיות שלה נמוכה מאוד וקשה להבחין בה בפרטים רבים. לשם כך פיתח פריץ זרניקה (Zernike) באמצע המאה ה-20 את מיקרוסקופיית ניגודיות המופעים, וזכה על כך בפרס נובל בפיזיקה. השיטה מאפשרת לשנות את הבהירות של חלק מקרני האור על פי פיזורן אחרי שהן פוגעות בפני שטח הדגימה. באופן זה חלק מהאזורים נראים כהים לעומת אחרים והפיזור משקף את צורת הדגימה. כך אפשר לראות מבנים שלא ניתן לראות בתאורה רגילה.

כל זה עדיין לא מאפשר לדעת מה קורה בתוך התאים. לשם כך כבר צריך להשתמש בצבענים (פיגמנטים) שצובעים אזורים מסוימים בתוך התא – למשל, הגרעין. כך אפשר להגביר את הניגודיות בדגימה (חישבו על תמונה בשחור-לבן לעומת תמונה צבעונית) וללמוד יותר על מבנים בתא ועל תהליכים בתוכו.

השיפור המשמעותי בניגודיות ובכושר ההפרדה הגיע עם כניסתה לשימוש של המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית. צבע פלואורסצנטי הוא חומר שמגיב לאור. כשמאירים עליו באור באורך גל מסוים, כלומר צבע מסוים, הוא בולע את האור ופולט אור בצבע אחר.

יש שתי שיטות עיקריות לסימון בצבע פלואורסצנטי. באחת יוצרים קישור כימי של צבע פלואורסצנטי למולקולות שמזהות חלבונים מסוימים בתא, למשל נוגדנים שמזהים חלבון ייחודי. בשנייה משתמשים בחלבון פלואורסצנטי, כמו אלה שנמצאים בגופם של יצורים ימיים מאירים כגון מדוזות, אלמוגים ואפילו צלופחים. החלבון הראשון מהסוג הזה שנכנס לשימוש הוא ה-GFP, שמקורו במדוזה וגילויו זיכה את אוסמו שימומורה (Shimomura), מרטין צ'לפי (Chalfie) ורוג'ר טסיין (Tsien) בפרס נובל בכימיה לשנת 2008.

כיום ידועים עוד מאות חלבונים פלואורסצנטיים בכל הצבעים. העקרון בשימוש בהם הוא שאפשר, בהנדסה גנטית, לאחות חלבון פלואורסנטי עם חלבון תאי שאנו מתעניינים בו. כך אפשר לזהות איפה נמצא החלבון שאנו מחפשים בתא, ולעקוב אחרי מולקולות בתאים חיים על פי האור שהן פולטות, במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

כושר ההפרדה של מיקרוסקופ נקבע על ידי שני פרמטרים. הראשון מכונה "הערך המספרי של הנקב" (Numerical Aperture, או בקיצור NA) והוא היכולת של המערכת האופטית לאסוף ולהפריד אור, בהתאם למרחק מהעצם הנחקר ולמדיום שדרכו אנו מסתכלים – למשל אוויר, מים או שמן. הפרמטר השני הוא אורך גל האור שמוקרן על הדגימה.

כושר ההפרדה של מיקרוסקופ אור נראה (אורכי גל של 700-400 ננומטר, כלומר מיליארדיות המטר) הוא כמחצית מאורך הגל, כלומר כ-200 ננומטר. עצמים משמעותיים רבים הם קטנים יותר מ-200 ננומטר, ולכן אי אפשר לצפות בהם כראוי במיקרוסקופ כזה. לדוגמה, תא אפיתל ברקמות המצפות את איברי הגוף מגיע לגודל של 30-20 מיקרון כלומר 30-20 אלף ננומטר ואפשר לראות היטב תאים כאלה במיקרוסקופ אור. קוטר התא של שמר אפייה הוא רק כחמישה מיקרון וחיידק הוא בגודל של כמיקרון אחד. גודלו של נגיף ממוצע הוא כ-50-30 ננומטר, ריבוזום הוא בגודל של כ-30 ננומטר וגודלו של חלבון בודד הוא כחמישה ננומטר. כל מבנה שנמצא מתחת לסף ההפרדה ייראה במיקרוסקופ פלואורסצנטי כנקודה בגודל של כ-200 ננומטר.

לפני כעשור החלו להשתמש בשיטות של סופר-רזולוציה, שזיכו אף הן את מפתחיהן אריק בציג (Betzig), ויליאם מורנר (Moerner) ושטפן הל (Hell) בפרס נובל בכימיה לשנת 2014. הטכנולוגיה הזאת מנצלת תכונה ייחודית של מולקולות פלואורסצנטיות – היכולת לכבות או להדליק את המולקולה, באמצעות שליטה בתאורה עליהן. לשם כך מצלמים עשרות או מאות אלפי תמונות, וכל תמונה "מדליקה" בכל פעם רק חלק מהמולקולות הפלואורסצנטיות. בעזרת אלגוריתמים חישוביים אפשר למפות היכן בדיוק נמצאת כל מולקולה וכך להגיע לכושר הפרדה של ננומטרים בודדים.

שקיפות מֵרבית

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היא אחת השיטות הנפוצות כיום לחקר המבנה של רקמות, של תאים ושל אברונים בתוך התא. אין בעיה לראות דרך שכבת תאים בודדה, שכן התאים שקופים למדי ומאפשרים מעבר אור בקלות. אולם כשמדובר בפיסת רקמה עבה יותר, שכבות התאים חוסמות את מעבר האור. בנוסף, האור שמצליח לעבור מתפזר במעבר דרך השכבות ומקבלים תמונה לא ממוקדת. לרוב אי אפשר לצפות לעומק של יותר מכ-20 מיקרון, כלומר שלוש-ארבע שכבות תאים. עד לאחרונה לא יכולנו לצפות במיקרוסקופ דרך איבר שלם, בלי לפרוס אותו לפרוסות דקות.

במאמר שפורסם ב-2013 בכתב העת Nature תוארה שיטה חדשה בשם "צלילוּת" (CLARITY) שמאפשרת לקחת כל איבר או רקמה בגוף ולגרום להם להיות שקופים. בשיטה, שפותחה במעבדה של קרל דייסרות' (Deisseroth) מאוניברסיטת סטנפורד, מחדירים לרקמה מעין ג'ל שקוף שהמולקולות שלו נקשרות באופן בלתי הפיך לחלבונים, ל-DNA ול-RNA. את המולקולות האחרות שבולעות את רוב האור – שומנים, סוכרים וכדומה – מסלקים באמצעים כימיים. הג'ל שומר על מבנה הרקמה, התאים והאברונים בתא.

סילוק המולקולות ה"מסתירות" מאפשר לצפות לעומק הרקמה (למשל מוח עכבר) באמצעות צביעות מיוחדות או ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים. התוצאה לא פחות ממדהימה, שכן היא איפשרה לראשונה לצפות איך התאים מסודרים יחד בתוך מוח שלם, לא פגוע.

אחת התכונות הייחודיות לתאי עצב היא יכולתם ליצור שלוחות ארוכות (אקסונים) המשמשות להעברת מסרים בין תאים ברחבי המוח, או בינו לבין איברים אחרים בגוף. כשפורסים מוח לפרוסות לצורך צפייה במיקרוסקופ, קשה מאוד לעקוב אחר אקסון יחיד מתחילתו ועד סופו, שכן סביר להניח שהוא ייחתך. בשיטת ה"צלילות" עקבו אחרי כל אקסון ואקסון במוח מתחילתו ועד סופו, וכך יצרו "מפת תקשורת" של כל תאי העצב במוח העכבר.

בשש השנים שחלפו מאז פיתוח השיטה היא הופצה למעבדות רבות ברחבי העולם, ונעשו בה שדרוגים שאפשרו להסתכל על איברים אחרים, עד כדי עכבר שלם. במאמר שהועלה לאחרונה לאתר הפרסום המוקדם bioRxiv, החוקרים עקבו אחר כל העצבים של עכבר לפרטי פרטים. לדוגמאות גדולות כאלה לא יכלו להשתמש במיקרוסקופ רגיל, ונעזרו במקום זאת בפיתוח חדש אחר: מיקרוסקופ יריעת אור פלואורסצנטי.

סרטון של העכבר השקוף מתוך המאמר המחקר: 

יריעות באפילה

את מיקרוסקופ יריעת האור המציאו בשנת 1903 הנרי זיידנטופף (Seidentopf) וריצ'רד אדולף זיגמונדי (Zsigmondy), שקראו לו אז אולטרה-מיקרוסקופ. הם העבירו אור לבן דרך חריץ רבוע וכך הצליחו לצפות בחלקיקים קטנים ממיקרון. אולם הרעיון נזנח למאה שנה, עד ששולב מחדש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מודרני.

בשנת 2004, פותחה שיטת מיקרוסקופיית יריעת אור בשם SPIM (קיצור של Single Plane Illumination Microscopy, כלומר תאורת מישור יחיד) שמאפשרת לצפות באורגניזם שלם. כפי שציינו, כשצופים ברקמה עבה במיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל האור נבלע ומתפזר. בנוסף, האור מפעיל את כל המולקולות הפלואורסצנטיות לכל עובי הדגימה, כך שמתקבלת תמונה מפוזרת ולא ממוקדת.

במיקרוסקופ יריעת אור יש שתי עדשות אובייקטיב הנמצאות בזווית של 90 מעלות זו מזו, בניגוד למיקרוסקופ רגיל שבו יש עדשת אובייקטיב אחת שדרכה האור מגיע מהדגימה לעין. בעדשה אחת מועברת יריעת האור לדגימה, והשנייה משמשת לקליטת האור הפלואורצסנטי. בדרך כלל יריעת האור היא ברוחב של כמה מיקרונים – עובי של שכבת תאים יחידה בדגימה. כך נמנעת ההפעלה של מולקולות פלואורסצנטיות באזורים אחרים של הדגימה והאור לא מתפזר דרך שכבות אחרות כמו במיקרוסקופ רגיל.

בנוסף, במיקרוסקופ יריעת אור אפשר להשתמש בעוצמת אור נמוכה יחסית למיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל. כך מצטמצמת התופעה של רעילות אור, כלומר נזק שנגרם למולקולות ביולוגיות כשהן נחשפות לאור, במיוחד בתחום הסגול-כחול. במיקרוסקופ הזה אפשר לעקוב אחרי התפתחות של עובר של עכבר אפילו לאורך שבוע, או לעקוב אחרי תאים ואברונים בתוך דג זברה חי.

סרטון התפתחות העובר של העכבר, שצולם בשיטת SPIM: 

לצפות בעזרת חיתול

לבסוף, הנוירוביולוג אד בוידן (Boyden) מצא דרך להשתמש בחיתולים כדי להסתכל על המוח. מוח האדם מורכב מכ-86 מיליארד תאי עצב ומספר דומה של תאים אחרים. בין התאים יש רשת סבוכה של קשרים בשם "סינפסות" שקשה לזהות כשצופים במיקרוסקופ בפיסת מוח במבט רחב. בנוסף, האותות בסינפסות מועברים באמצעות ביו-מולקולות ובועיות זעירות הקטנות מכושר ההפרדה של מיקרוסקופים אופטיים. אומנם אפשר להשתמש לשם כך במיקרוסקופ סופר-רזולוציה, אך עלותו גבוהה ולא כל מעבדה יכולה להרשות לעצמה לרכוש אותו. בנוסף, במיקרוסקופים האלה מסובך לצפות ברקמה עבה.

בוידן החליט לנקוט בגישה אחרת. במקום להגדיל את כושר ההפרדה של המיקרוסקופ, למה לא להגדיל את הדוגמה? בחיתולים חד-פעמיים לתינוקות קיים חומר שמתנפח במגע עם מים. במיקרוסקופיית הרחבה מכניסים לתוך הדגימה את המולקולות הללו, שיוצרות קשרים כימיים עם כל המולקולות הביולוגיות: חלבונים, DNA ו-RNA. לאחר מכן מוסיפים מים – והדגימה הביולוגית מתרחבת עד פי 20 מגודלה המקורי, בלי לשנות את הסידור של המולקולות במרחב, כמו שקורה לציור על בלון בזמן שמנפחים אותו.

המאמר הראשון בנושא, שפורסם בשנת 2015, הראה ניפוח של דגימה פי ארבעה, כלומר כושר הפרדה אפקטיבי של 70 ננומטר במקום יותר מ-200 במיקרוסקופ רגיל. מאז התפרסמו יותר מ-30 מחקרים שהשתמשו בשיטה זו ושכללו אותה עד כדי ניפוח של דגימה פי 20, וכושר הפרדה של 25 ננומטר – שווה ערך לשיטות מיקרוסקופיה של סופר-רזולוציה, אך זול הרבה יותר.

הרצאת TED של אד בוידן על פריצת הדרך שלו במיקרוסקופיה (באנגלית):